7月18日，赛业生物细胞基因编辑项目管理常天一主讲「基因编辑细胞技术及其研究应用」线上课程，以下为本次直播常见问题汇总与解答。

FAQ:

1.细胞编辑移码敲除和片段敲除该如何选择？

2.如何提高点突变项目的成功率？

3.基因敲入细胞系构建原理？

4.iPSC重编程都会做哪些检测？

5.敲除细胞系出现WB检测蛋白残留该如何解决？

6.基因敲除细胞系构建的实验难点和注意事项？

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Q：细胞编辑移码敲除和片段敲除该如何选择？

A ：移码敲除是指使用一条sgRNA在蛋白编码基因的外显子内产生双链断裂，若NHEJ修复导致了缺口处产生了非3倍数的删除或者插入，则会造成蛋白翻译时的读码框移码（Framshift），从而产生一个截短的、功能失活的蛋白质。

片段敲除是指在目的敲除位置两侧各设计一条gRNA，两条gRNA同时作用形成两个DSB，NHEJ修复造成目的DNA片段的缺失，从而导致该片段中包含的基因失去功能。

两种方案都是可行的敲除方案，我们会根据目的基因信息，是否有文献报道等情况，综合考量使用哪种方案。

Q：如何提高点突变项目的成功率？

A：点突变的项目的成功率和cell pool阶段的同源重组效率密切相关。赛业生物优化的α-donor体系将人源化的Cas蛋白、gRNA和donor三组分转染至目的细胞，HDR效率高达87%，实现单克隆纯合子交付，快至6周。

Q：基因敲入细胞系构建原理？

A：sgRNA和Cas蛋白使目的位置发生双链断裂，同时引入了一个donor，donor中包含要插入的DNA序列、和目标基因组位置同源的DNA序列（同源臂），利用同源重组修复（HDR）机制来修复双链断裂，将外源DNA序列插入到目标位置。

Q：iPSC重编程都会做哪些检测？

A：iPSC重编程检测内容包括无菌支原体检测、质粒残留分析、STR鉴定、核型分析、免疫荧光、流式检测、体外三胚层检测，畸胎瘤实验。

出现WB检测蛋白残留可能的原因：

Western Blot抗体的选择不合适；

基因的可变剪切引起的蛋白残留；

由于目的基因的多转录本引起的蛋白残留；

目的蛋白本底表达低；

遗传补偿效应：无义突变和同源序列。

可参考Western blot trouble shooting思路图进行原因排查。

1.细胞和基因信息分析

确保细胞和基因的准确性；

核对敲除策略和gRNA设计位置，确保gRNA设计在保守区域且尽可能覆盖所有转录本；

分析目的基因是否有同源基因，如有同源基因可能会存在遗传补偿效应；

分析目的基因在宿主细胞内的本底表达水平，相应调整Western blot参数。

2.DNA水平分析

检查鉴定策略是否合适，PCR电泳条带与预期是否一致；

核查测序原始数据，测序质量是否合格，分析测序结果检查是否还有未敲除干净的序列，与野生型序列进行比对确保敲除成功。

3.mRNA水平分析

两种方法可以在mRNA水平进行验证：

方法1：使用赛业生物RDDC罕见病数据中心对突变进行可变剪切预测，如产生移码和提前终止，则认为mRNA水平敲除合格。

方法2：提取细胞mRNA进行cDNA PCR和测序，并与野生型进行比对，确定mRNA水平是否敲除成功。

4.蛋白水平分析

根据DNA测序结果，使用相应软件将KO后的DNA翻译成氨基酸序列，并与野生型氨基酸序列进行比对，确定氨基酸水平是否发生敲除。

5.抗体分析

KO验证和文献验证更优，比对抗体免疫原位点与敲除区域位点，免疫原位点C端优于N端，核对抗体是单克隆或者多克隆，单克隆优于多克隆；抗体的品牌，进口优于国产。

Q: 基因敲除细胞系构建的实验难点和注意事项？

1.分子设计方面的难点：

敲除策略选择不当；

基因拷贝数多，gRNA切割不彻底；

gRNA设计位置不当，如未能覆盖重要转录本；

gRNA设计不当，如效率低，脱靶率高等。

解决方法：在分子设计方面结合赛业生物Smart CRISPR基因编辑系统和经验丰富的生信分子团队进行相应的基因分析和设计，确保敲除成功。

2.细胞方面的难点：

递送方式、培养、转染和单克隆制备困难。

解决方法：递送方式建议选择RNP，效率高且低脱靶，摸索细胞培养条件，优化转染方法和单克隆，确保敲除实验前获取最优条件。